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Interview: Langzeitstudie mit Vorbildwirkung

Seit 2/4: Von internationalen Testrichtlinien und Guter Labor-Praxis
 

So eine Untersuchung läuft in mehreren Etappen. Wie sah die erste aus?

Das Erste war die Planung und die Beratungen mit den Experten aus der ganzen Welt. Wir haben überlegt: Welche Versuchsprotokolle, welche Zusatzuntersuchungen, welche Materialien, welche Dosierungen richtig sind. Parallel dazu musste natürlich auch die Finanzierung geklärt werden.

Und dann ging es darum, die Testsubstanzen zu bekommen. Es war schnell klar, dass wir Nanomaterialien von der OECD-Forschungsliste wählen. Die ausgewählten Ceroxid und Bariumsulfat sind aber keine BASF-Substanzen, sondern von anderen Herstellern. Deshalb mussten wir an die Hersteller herantreten und sie bitten, uns Material zu geben. Das hört sich einfach an, ist es aber nicht unbedingt. Jemanden zu überzeugen, Material für eine toxikologische Studie zur Verfügung zu stellen, auf die er selbst keinen Einfluss hat, ist nicht ganz unproblematisch. Die beiden Hersteller haben aber bereitwillig mitgemacht.
 

Bariumsulfat, wie es im Versuch verwendet wurde.  (Bild: BASF)
Bariumsulfat, wie es im Versuch verwendet wurde. (Bild: BASF)
Es ging ja ums Einatmen, die Nanopartikel wurden also in Luft fein verteilt?

Ja, das Aerosol wurde fortlaufend generiert und durchströmte die Expositionskammern, die wir dafür übrigens extra gebaut haben. Wichtig war dabei, dass das Aerosol homogen (Anm.: gleichmäßig) in der Inhalationskammer verteilt wurde und die Partikelgrößen sowie die Konzentrationen stimmen.

Um sicher zu sein, dass es funktioniert haben wir 100 Stoffratten gekauft und mit denen ein Jahr lang geprobt, ob und wie die Technik funktioniert und auch, wie man die Anlage reinigt. Auch dafür mussten extra Geräte gebaut werden. Es gab viele Details zu klären und Herausforderungen zu meistern. Auch die Zeitpläne waren aufwändig – es hat Monate gedauert, bis wir wussten, wie hier alles ineinandergreift. Letztlich dauerten die Vorversuche zwei Jahre.
 

Nano in Vivo folgte streng den OECD-Test-Richtlinien. Die Studie wurde außerdem unter den Bedingungen der Guten Laborpraxis durchgeführt. Was bedeutet das im Einzelnen?

GLP ist dafür da, die Versuche fälschungssicher und nachvollziehbar zu machen. Das bedeutet: Man schreibt vorher auf, was man machen will. Das ist der Prüfplan. Dann erhebt man die Daten und archiviert sie GLP-gerecht. Das heißt, sie werden weggeschlossen, archiviert und können dann nicht mehr geändert werden. Abschließend wird ein Bericht geschrieben. Und das Ganze – der Prüfplan, die Rohdatenaufzeichnung und der Bericht – wird dann von der Qualitätssicherung geprüft. Die Kollegen lesen jede Seite und prüfen alle Zahlen nach.
 

Für seine Arbeit zu Entwicklung von Alternativen zu Tierversuchen erhielten Dr. Landsiedel und sein Team unter anderem den Bundesforschungspreis für Tierschutz und den Landespreis für die Entwicklung von Alternativen zu Tierversuchen Rheinland-Pfalz. (Foto: MLR / Magali Hauser)
Für diese Untersuchung wurden 500 Ratten eingesetzt. Hätte es nicht auch In-Vitro-Methoden gegeben?

Es gab zuvor viele BMBF- und EU-Nano-Forschungsprojekte, die sehr viele In-vitro-Methoden, also tierversuchsfreie Methoden, genutzt haben – und auch wir entwickeln und nutzen In-vitro-Methoden. Aber bei Untersuchungen zur Langzeitwirkung ist das per se schwierig, weil In-vitro-Systeme in der Regel keine Langzeitsysteme sind. Der Tierversuch hat zwar den großen Nachteil, dass man nur an einem Modellorganismus testet, aber den großen Vorteil, dass man einen Gesamtorganismus untersuchen kann. In-vitro-Systeme haben das umgekehrte Problem: Man kann an menschlichen Zellen oder Geweben testen, aber eben immer nur an einem Teil des Gesamtorganismus. Und wie die einzelnen Teile zusammenwirken weiß man oft nicht.

Wir haben in der Langzeitstudie über 40 Organe untersucht, die Zahl der In-vitro-Systeme wäre sehr groß und es stehen noch längst nicht für alle Vorgänge im Organismus geeignete In-vitro Systeme zur Verfügung. Und: Wir brauchen zumindest ein paar gute In-vivo-Daten, um dann überhaupt In-vitro-Systeme entwickeln zu können, die die relevanten Schritte abbilden.
 

Warum wurde diese Untersuchung an Ratten gemacht?

Wir wollten eine Studie nach OECD-Richtlinien machen. Sie sollte standardisiert und regulatorisch nutzbar sein. Deshalb haben wir die Materialien aus der OECD-Liste genommen und nach dem OECD-Standard-Protokoll getestet. Und da ist die Ratte das vorgeschriebene Modell.
 

Wie lang atmeten die Tiere die Luft-Nanopartikel-Mischung ein?

Die Tiere kamen morgens in die Inhalationskammer und nach sechs Stunden wieder zurück in ihren Stall. Sie leben in Kleingruppen zusammen – in denen bleiben sie auch.

Wir machen hier viele Kurzzeit-Studien nach OECD-Standards, so dass wir damit Erfahrung haben: So gibt es eigene Räumlichkeiten zur Unterbringung der Tiere, die nicht weit weg vom Versuchslabor sind. Tierpfleger kümmern sich um die Ratten. Und natürlich halten wir das deutsche Tierschutzgesetz ein sowie und auch internationale, höhere Standards. Der höchste ist AAALAC (Anm.: Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). Wie alle Studien in unserem Labor, war auch die Nano-in-Vivo-Studie AAALAC-zertifiziert.
 

Nano in Vivo ist ausdrücklich eine Langzeitstudie. Was bedeutet das?

Die Dauer der Studie beträgt zwei Jahre. Das ist in etwa die natürliche Lebenszeit einer Ratte. Zusätzlich gab es eine Tier-Gruppe, die ein halbes Jahr länger beobachtet wurde. Das entspricht beim Menschen einem Alter von über 80 Jahren. Dies war ein Vorschlag von der BAuA, denn Tumore entwickeln sich eher am Ende des Lebens. Und je länger man lebt, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass man einen Tumor bekommt.
 

Wie und wann wurden die Tiere untersucht?

Die Tiere wurden während der Versuchszeit regelmäßig von Tierärzten untersucht. Am Ende der Studie wurden die Organe der Tiere komplett nach der OECD-Richtlinie geprüft. Ein Großteil ging dabei an die Pathologie des Fraunhofer-Instituts in Hannover. Anschließend haben wir auch anderen Forschungsgruppen Material angeboten, wenn sie weitere Fragestellungen klären wollten. Es gab viele Zusatzuntersuchungen an anderen Instituten. Manche wollten das Gehirn untersuchen, manche das Knochenmark. Das Beratergremium hat jedoch zuvor bewertet, ob das technisch möglich ist und unsere eigene Studie nicht gefährdet.
 

Objektträger mit Organpräparaten. Um Gewebeänderungen erkennen zu können, wurden die Organproben hauchdünn geschnitten. Pro Tier wurden über 60 Schnitte der Lunge gefertigt und untersucht. (Foto: Ph. D. Dirk Schaudien, Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin)
Für eine histopathologische Untersuchung werden die Organe ultradünn geschnitten, gefärbt und dann von den Experten für Gewebeveränderungen begutachtet. Wie viele Proben haben sie für Nano in Vivo untersucht?

Allein für die Lunge waren das nach zwei Jahren schließlich 35.000 Präparate. Nach 30 Monaten dann ungefähr noch einmal so viele. Alle anderen Organe, die wir untersucht haben, kamen schließlich noch dazu. Letztlich wurden also mehrere Zehntausend Objektträger einzeln ausgewertet.

Für die kritischen und spannenden Befunde wurde nochmal eine Review-Gruppe aus externen Pathologen eingeladen (Anm: eine Gruppe von Gutachtern), um die Befunde zu bestätigen und fragliche Fälle zu besprechen. Außerdem sind relativ viele Proben zur Analytik gegangen. Weil wir nicht nur wissen wollten, was in einem Organ passiert, sondern auch, wie viel Nanomaterial dort angekommen ist.
 

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